Голодування та рак: молекулярні механізми та клінічне застосування

Алессіо Ненсіоні, Ірен Каффа, Сальваторе Кортелліно та Вальтер Д. Лонго

Анотація | Уразливість ракових клітин до нестачі поживних речовин та їхня залежність від конкретних метаболітів є ознаками раку. Голодування або дієти, що імітують голодування (FMDs) призводять до значних змін у факторах росту та рівнях метаболітів, створюючи середовище, яке може зменшити здатність ракових клітин адаптуватися та виживати, і таким чином покращуючи ефекти лікування раку. Крім того, голодування або ящур підвищують стійкість до хіміотерапії у нормальних, але не ракових клітин, і сприяють регенерації в нормальних тканинах, що може допомогти запобігти шкідливим і потенційно небезпечним для життя побічним ефектам лікування. Хоча пацієнти погано переносять голодування, як дослідження на тваринах, так і клінічні дослідження показують, що цикли низькокалорійних ящурів є здійсненними та в цілому безпечними. Кілька клінічних випробувань, які оцінюють вплив голодування або ящуру на побічні явища, що виникли при лікуванні, та на результати ефективності тривають. Ми вважаємо, що комбінація ящуру з хіміотерапією, імунотерапією або іншими методами лікування є потенційно перспективною стратегією для підвищення ефективності лікування, запобігання придбання резистентності та зменшення побічних ефектів.

Фактори харчування та способу життя є ключовими факторами, що визначають ризик розвитку раку, причому деякі види раку більше залежать від харчових звичок, ніж інші1�9. Згідно з цією ідеєю, ожиріння, за оцінками, становить від 14% до 20% усієї смертності, пов’язаної з раком, у Сполучених Штатах7, що призводить до рекомендацій щодо харчування та фізичної активності для зниження ризику розвитку раку6. Крім того, зважаючи на схильність ракових клітин, але не нормальних тканин, не слухатися сигналів проти росту (через онкогенні мутації)10 та їх нездатність належним чином адаптуватися до умов голодування11,12, зростає інтерес до можливості того, що певні дієти з обмеженим вмістом калорій також можуть стати невід’ємною частиною профілактики раку і, можливо, лікування раку як засобу підвищення ефективності та переносимості протипухлинних засобів11–13.

Незважаючи на те, що за останнє десятиліття ми стали свідками безпрецедентних змін і помітного прогресу в лікуванні раку14,15, залишається нагальна потреба в більш ефективних і, можливо, лікувальних підходах до пухлин, а також, що не менш важливо, у стратегіях зменшення побічних наслідки лікування раку15,16. Питання побічних ефектів, що виникають під час лікування (TEAE), є однією з ключових перешкод у медичній онкології15,16. Насправді багато хворих на рак відчувають гострі та/або довготривалі побічні ефекти лікування раку, що може вимагати госпіталізації та агресивного лікування (таких як антибіотики, гемопоетичні фактори росту та переливання крові) і суттєво вплинути на якість їхнього життя (наприклад, хіміотерапія). периферична нейропатія)16. Таким чином, ефективні стратегії пом’якшення токсичності виправдані та, як очікується, матимуть серйозний медичний, соціальний та економічний вплив15,16.

Голодування змушує здорові клітини перейти до повільного поділу та високозахищеного режиму, який захищає їх від токсичних впливів протипухлинних препаратів, одночасно сенсибілізуючи різні типи ракових клітин до цих терапевтичних засобів11,12,17. Це відкриття означає, що одне дієтичне втручання потенційно може допомогти вирішити різні і однаково важливі аспекти лікування раку.

У цій статті Opinion ми обговорюємо біологічне обґрунтування використання голодування або дієт, що імітують голодування (FMDs), щоб притупити TEAE, а також для запобігання та лікування раку. Ми також ілюструємо застереження цього експериментального підходу18,19 та опублікованих та поточних клінічних досліджень, у яких голодування або ящур застосовувалися до пацієнтів з раком.

Системна та клітинна реакція на голодування

Голодування призводить до змін у активності багатьох метаболічних шляхів, пов’язаних із перемиканням у режим, здатний генерувати енергію та метаболіти з використанням джерел вуглецю, що вивільняються переважно з жирової тканини та частково з м’язів. Зміни в рівнях циркулюючих гормонів і метаболітів призводять до зменшення поділу клітин і метаболічна активність нормальних клітин і в кінцевому підсумку захищає їх від хіміотерапевтичних ушкоджень11,12. Ракові клітини, порушуючи накази проти росту, продиктовані цими умовами голодування, можуть мати протилежну реакцію нормальних клітин і, отже, стати чутливими до хіміотерапії та інших методів лікування раку.

Системна реакція на голодування

Відповідь на голодування частково регулюється циркулюючими рівнями глюкози, інсуліну, глюкагону, гормону росту (GH), IGF1, глюкокортикоїдів та адреналіну. Під час початкової фази після всмоктування, яка зазвичай триває 6–24 години, рівень інсуліну починає падати, а рівень глюкагону зростає, сприяючи розщепленню запасів глікогену в печінці (які вичерпуються приблизно через 24 години) і відповідному вивільненню глюкози для отримання енергії.

Глюкагон і низький рівень інсуліну також стимулюють розпад тригліцеридів (які в основному зберігаються в жировій тканині) на гліцерин і вільні жирні кислоти. Під час голодування більшість тканин використовує жирні кислоти для отримання енергії, тоді як мозок покладається на глюкозу та кетонові тіла, що виробляються гепатоцитами (кетонові тіла можуть вироблятися з ацетил-КоА, що утворюється в результаті ?-окислення жирних кислот або з кетогенних амінокислот). У кетогенній фазі голодування кетонові тіла досягають концентрації в мілімолярному діапазоні, зазвичай починаючи через 2 дні від початку голодування. Разом з гліцерином та амінокислотами, отриманими з жиру, кетонові тіла підтримують глюконеогенез, який підтримує рівень глюкози в концентрації приблизно 3 мМ (4 мг на дл), яка в основному використовується мозком.

Глюкокортикоїди та адреналін також сприяють метаболічній адаптації до голодування, допомагаючи підтримувати рівень цукру в крові та стимулюючи ліполіз20,21. Примітно, що хоча голодування може принаймні тимчасово підвищити рівень GH (для посилення глюконеогенезу та ліполізу та зменшення периферичного поглинання глюкози), голодування знижує рівень IGF1. Крім того, в умовах голодування біологічна активність IGF1 частково стримується підвищенням рівня білка 1, що зв’язує інсуліноподібний фактор росту (IGFBP1), який зв’язується з циркулюючим IGF1 і запобігає його взаємодії з відповідним рецептором клітинної поверхні22.

Нарешті, голодування знижує рівень циркулюючого лептину, гормону, що виробляється переважно адипоцитами, який пригнічує відчуття голоду, одночасно збільшуючи рівень адипонектину, який збільшує розпад жирних кислот23,24. Таким чином, у висновку, характерними ознаками системної реакції ссавців на голодування є низький рівень глюкози та інсуліну, високий рівень глюкагону та кетонових тіл, низький рівень IGF1 та лептину та високий рівень адипонектину.

Реакція клітин на голодування

Реакція здорових клітин на голодування є еволюційно консервативною та забезпечує захист клітин, і, принаймні в модельних організмах, було показано, що вона збільшує тривалість життя та здоров’я12,22,25�31. Сигнальний каскад IGF1 є ключовим сигнальним шляхом, який бере участь у опосередкуванні ефектів голодування на клітинному рівні. При нормальному харчуванні споживання білка і підвищений рівень амінокислот підвищують рівень IGF1 і стимулюють активність AKT і mTOR, тим самим прискорюючи синтез білка. Навпаки, під час голодування рівні IGF1 і низхідна передача сигналів знижуються, зменшуючи опосередковане АКТ інгібування факторів транскрипції FOXO ссавців і дозволяючи цим факторам транскрипції трансактивувати гени, що призводить до активації таких ферментів, як гемоксигеназа 1 (HO1), супероксиддисмутаза ( SOD) і каталаза з антиоксидантною активністю та захисними ефектами32�34. Високий рівень глюкози стимулює передачу сигналів протеїнкінази А (PKA), яка негативно регулює AMP-активовану протеїнкіназу (AMPK)35 головного датчика енергії, яка, у свою чергу, запобігає експресії фактора транскрипції стресостійкості білка 1 ранньої реакції росту (EGR1). ) (Msn2 та/або Msn4 у дріжджах)26,36.

Голодування та пов’язане з цим обмеження глюкози пригнічують активність PKA, підвищують активність AMPK та активують EGR1 і, таким чином, досягають захисних ефектів клітин, у тому числі в міокарді22,25,26. Нарешті, голодування та ящур (їх склад див. нижче) також мають здатність сприяти регенеративним ефектам (Вставка 1) за допомогою молекулярних механізмів, деякі з яких були причетні до раку, наприклад, збільшення аутофагії або індукції активності сиртуїну22,37�49 .

Дієтичні підходи при ящурах раку

Дієтичні підходи, засновані на голодуванні, які були більш детально досліджені в онкології, як доклінічно, так і клінічно, включають водне голодування (утримання від будь-якої їжі та напоїв, крім води) та ящур11,12,17,25,26,50�60 (табл. 1). Попередні клінічні дані вказують на те, що для досягнення клінічно значущого ефекту в онкології, наприклад для запобігання спричиненого хіміотерапією пошкодження ДНК здорових тканин і підтримки якості життя пацієнта під час хіміотерапії, може знадобитися голодування протягом щонайменше 48 годин52,53,61.

Однак більшість пацієнтів відмовляються або мають труднощі з дотриманням водного голодування, і потенційний ризик дефіциту калорій і мікроелементів, пов’язаного з цим, важко виправдати. Ящур — це розроблені медичними методами дієтичні режими з дуже низьким вмістом калорій (тобто, як правило, від 300 до 1,100 ккал на день), цукру та білків, які відтворюють багато ефектів голодування лише на воді, але з кращим дотриманням пацієнтом і зниженим ризиком харчування22,61,62, 3 Під час ящуру пацієнти зазвичай отримують необмежену кількість води, невеликі стандартні порції овочевих бульйонів, супів, соків, горіхових батончиків і трав’яних чаїв, а також мікроелементів. У клінічному дослідженні 5-х місячних циклів 1-денного ящуру у загалом здорових добровольців дієта добре переносилася і зменшувала тулуб і загальний жир, кров’яний тиск і рівні IGF62. У попередніх і поточних онкологічних клінічних дослідженнях натщесерце або ящур зазвичай призначали кожні 3 тижні, наприклад, у поєднанні зі схемами хіміотерапії, і їх тривалість коливалася від 4 до 1 днів5 . Важливо, що жодних серйозних побічних явищ (рівень G52,53,58,61,63 або вище, згідно з загальними термінологічними критеріями для побічних явищ) не повідомлялося в цих дослідженнях68.

Кетогенні дієти

Кетогенні дієти (КД) – це режими харчування, які мають нормальну калорійність, високий вміст жирів і низький вміст вуглеводів69,70. У класичній КД співвідношення між масою жиру та загальною масою вуглеводів і білків становить 4:1. Слід зазначити, що ящури також є кетогенними, оскільки вони мають високий вміст жирів і здатні викликати значне підвищення (≥0.5 ммоль на літр) рівня циркулюючих кетонових тіл. У людей КД також може знижувати рівні IGF1 та інсуліну (більш ніж на 20% від вихідних значень), хоча на ці ефекти впливають рівні та типи вуглеводів і білка в дієті71. КД можуть знижувати рівень глюкози в крові, але зазвичай вони залишаються в межах норми (тобто >4.4 ммоль на літр)71.

Примітно, що КД можуть бути ефективними для запобігання підвищенню рівня глюкози та інсуліну, яке зазвичай відбувається у відповідь на інгібітори PI3K, що, як було запропоновано, обмежує їхню ефективність72. Традиційно КД використовувалися для лікування резистентної епілепсії, головним чином у дітей69. У мишачих моделях KD викликають протипухлинні ефекти, особливо при гліобластомі70,72�86. Клінічні дослідження вказують на те, що KDs, ймовірно, не мають істотної терапевтичної активності при застосуванні як монопрепаратів у хворих на рак, і припускають, що потенційні переваги цих дієт слід шукати в поєднанні з іншими підходами, такими як хіміотерапія, променева терапія, антиангіогенне лікування, інгібітори PI3K і FMDs72,73. ,XNUMX.

Повідомлялося, що КД мають нейропротекторну дію на периферичні нерви та гіпокамп87,88. Однак залишається встановити, чи мають KD також прорегенеративну дію, подібну до голодування або ящуру (вставка 1), і чи можна також використовувати KD для захисту живих ссавців від токсичності хіміотерапії. Примітно, що регенеративні ефекти голодування або ящуру, мабуть, максимізуються за рахунок перемикання з режиму реагування на голодування, який включає розпад клітинних компонентів і загибель багатьох клітин, а також період повторного харчування, під час якого клітини і тканини зазнають реконструкція22. Оскільки КД не примушують перейти в режим голодування, не сприяють значному розпаду внутрішньоклітинних компонентів і тканин і не включають період повторного годування, вони навряд чи викличуть тип скоординованої регенерації, який спостерігається під час повторного годування ящуру.

Обмеження калорійності

Хоча хронічне обмеження калорій (CR) і дієти з дефіцитом специфічних амінокислот сильно відрізняються від періодичного голодування, вони поділяють з голодуванням і ящурами більш-менш селективне обмеження поживних речовин, і вони мають протипухлинний ефект81,89. CR зазвичай включає хронічне зниження споживання енергії на 112% порівняно зі стандартним споживанням калорій, що дозволить людині підтримувати нормальну вагу20. Він дуже ефективний для зниження серцево-судинних факторів ризику та захворюваності на рак у модельних організмів, включаючи приматів30.

Однак CR може викликати побічні ефекти, такі як зміни зовнішнього вигляду, підвищена чутливість до холоду, зниження сили, порушення менструального циклу, безпліддя, втрата лібідо, остеопороз, повільне загоєння ран, нав’язлива думка, дратівливість і депресія. У пацієнтів з раком є ​​серйозні побоювання, що це може посилити недоїдання і що це неминуче призведе до надмірної втрати м’язової маси тіла18,113. CR знижує рівень глюкози в крові натще, хоча вони залишаються в межах норми116. У людей хронічний CR не впливає на рівень IGF114, якщо також не реалізовано помірне обмеження білка1.

Дослідження показують, що, зменшуючи передачу сигналів mTORC1 в клітинах Панета, CR посилює їх функцію стовбурових клітин і що він також захищає резервні стовбурові клітини кишечника від пошкодження ДНК118,119, але невідомо, чи CR також викликає прорегенеративні ефекти в інших органах. Таким чином, наявні дані свідчать про те, що голодування та ящур створюють метаболічний, регенеративний та захисний профіль, який є відмінним і, ймовірно, більш потужним, ніж той, що викликається KD або CR.

Голодування та ящур в терапії: вплив на рівень гормонів і метаболітів

Багато змін у рівнях циркулюючих гормонів і метаболітів, які зазвичай спостерігаються у відповідь на голодування, мають здатність виявляти протипухлинну дію (тобто знижувати рівень глюкози, IGF1, інсуліну та лептину та підвищувати рівні адипонектину)23,120,121 та/ або для захисту здорових тканин від побічних ефектів (тобто зниження рівня IGF1 і глюкози). Оскільки кетонові тіла можуть інгібувати гістондеацетилазу (HDAC), збільшення кетонових тіл, викликане голодуванням, може сприяти уповільненню росту пухлини та сприяти диференціації через епігенетичні механізми122.

Проте було показано, що ацетоацетат кетонового тіла прискорює, а не зменшує ріст деяких пухлин, таких як меланома з мутованим BRAF123. Ті зміни, щодо яких є найсильніші докази ролі в сприятливих ефектах голодування та ящуру проти раку, — це зниження рівня IGF1 та глюкози. На молекулярному рівні голодування або ящур зменшують внутрішньоклітинні каскади сигналів, включаючи передачу сигналів IGF1R�AKT�mTOR�S6K і cAMP�PKA, збільшують аутофагію, допомагають нормальним клітинам протистояти стресу і сприяють протипухлинному імунітету25,29,56,124

Диференційна стресостійкість: підвищення переносимості хіміотерапії

Деякі ортологи онкогенів дріжджів, такі як Ras і Sch9 (функціональний ортолог S6K ссавців), здатні знижувати стійкість до стресу в модельних організмах 27,28, 1. Крім того, мутації, які активують IGF3R, RAS, PI10KCA або AKT, або які інактивують PTEN, присутні в більшості ракових захворювань людиниXNUMX. Разом це призвело до гіпотези про те, що голодування призведе до протилежних ефектів у ракових клітинах порівняно з нормальними клітинами з точки зору їхньої здатності протистояти клітинним стресам, включаючи хіміопрепарати. Іншими словами, голодування може призвести до диференціальної стійкості до стресу (DSR) між нормальними та раковими клітинами.

Згідно з гіпотезою DSR, нормальні клітини реагують на голодування, знижуючи регуляцію проліферації, асоційованої з біогенезом рибосом та/або генів збірки, що змушує клітини переходити в режим самопідтримки та захищає їх від пошкоджень, спричинених хіміотерапією, радіотерапією та іншими токсичними агентами. Навпаки, у ракових клітинах цей режим самопідтримки запобігає через онкогенні зміни, які викликають конститутивне інгібування шляхів реакції на стрес12 (рис. 1). Згідно з моделлю DSR, короткочасне голодування або видалення гомологів протоонкогену (тобто Sch9 або обох Sch9 і Ras2) посилюють захист Saccharomyces cerevisiae від окислювального стресу або хіміотерапевтичних препаратів до 100 разів порівняно з дріжджами клітини, що експресують конститутивно активний гомолог онкогену Ras2val19.

Подібні результати були отримані в клітинах ссавців: вплив середовища з низьким вмістом глюкози захищав первинні клітини глії миші від токсичності перекису водню або циклофосфаміду (прооксидантний хіміотерапевтичний засіб), але не захищав лінії клітин гліоми та нейробластоми миші, щура та людини. Згідно з цими спостереженнями, 2-денне голодування ефективно збільшило виживаність мишей, які отримували високі дози етопозиду, порівняно з мишами, які не голодували, і підвищило виживаність мишей із алотрансплантатом нейробластоми порівняно з мишами, які не голодували, з пухлиною12.

Подальші дослідження показали, що знижена передача сигналів IGF1 у відповідь на голодування захищає первинну глію та нейрони, але не клітини гліоми та нейробластоми, від циклофосфаміду та прооксидативних сполук, а також захищає фібробласти ембріонів миші від доксорубіцину29. Миші з дефіцитом IGF1 (LID) у печінці, трансгенні тварини з умовною делецією гена Igf1 у печінці, які демонструють зниження рівня циркулюючого IGF70 на 80% (рівні, подібні до тих, що досягаються при 1-годинному голодуванні у мишей)72, були захищені від три з чотирьох протестованих хіміотерапевтичних препаратів, включаючи доксорубіцин.

Гістологічні дослідження показали ознаки серцевої міопатії, спричиненої доксорубіцином, лише у контрольних мишей, які отримували доксорубіцин, але не у мишей LID. У експериментах з тваринами-носячками меланоми, які отримували доксорубіцин, не спостерігалося різниці в прогресуванні захворювання між контрольними мишами та мишами LID, що вказує на те, що ракові клітини не були захищені від хіміотерапії за рахунок зниження рівня IGF1. Проте, знову ж таки, миші LID з пухлинами показали значну перевагу у виживанні порівняно з контрольними тваринами завдяки їх здатності протистояти токсичності доксорубіцину29. Таким чином, загалом, ці результати підтвердили, що зниження регуляції IGF1 є ключовим механізмом, за допомогою якого голодування підвищує переносимість хіміотерапії.

Як дексаметазон, так і інгібітори mTOR широко використовуються в лікуванні раку через їхню ефективність як протиблювотні та протиалергічні засоби (тобто кортикостероїди) або через їхні протипухлинні властивості (тобто кортикостероїди та інгібітори mTOR). Однак одним із їхніх основних побічних ефектів, які часто обмежують дозу, є гіперглікемія. Відповідно до уявлення про те, що підвищена передача сигналів глюкози цАМФ PKA знижує резистентність до токсичності хіміотерапевтичних препаратів 12,26,126, 26, 26, як дексаметазон, так і рапаміцин збільшують токсичність доксорубіцину в мишачих кардіоміоцитах і мишах XNUMX. Цікаво, що вдалося усунути таку токсичність шляхом зниження рівня циркулюючої глюкози за допомогою ін’єкцій інсуліну або натще.

Ці втручання знижують активність PKA, одночасно збільшуючи активність AMPK і, таким чином, активуючи EGR1, що вказує на те, що сигналізація cAMP� PKA опосередковує DSR, викликану голодуванням через EGR1 (посилання 26). EGR1 також сприяє експресії кардіопротекторних пептидів, таких як передсердний натрійуретичний пептид (ANP) і натрійуретичний пептид B-типу (BNP) в серцевій тканині, що сприяє резистентності до доксорубіцину. Крім того, голодування та/або ящур можуть захистити мишей від кардіоміопатії, спричиненої доксорубіцином, посилюючи аутофагію, що може сприяти здоров’ю клітин за рахунок зменшення виробництва активних форм кисню (ROS) шляхом усунення дисфункціональних мітохондрій та видалення токсичних агрегатів.

На додаток до зниження токсичності, спричиненої хіміотерапією, у клітинах та збільшення виживання мишей, які отримували хіміотерапію, цикли голодування індукують регенерацію кісткового мозку та запобігають імуносупресії, спричиненої циклофосфамідом, пов’язаним із PKA та IGF1 способом25. Таким чином, переконливі доклінічні результати вказують на потенціал голодування та ящуру для підвищення переносимості хіміотерапії та уникнення серйозних побічних ефектів. Оскільки початкові клінічні дані ще більше підтверджують цей потенціал, ці доклінічні дослідження створюють вагоме обґрунтування для оцінки ящуру в рандомізованих клінічних дослідженнях з TEAE як основною кінцевою точкою.

Диференціальна стресова сенсибілізація: збільшення загибелі ракових клітин

Якщо використовувати їх окремо, більшість дієтичних втручань, включаючи голодування та ящур, мають обмежений вплив на прогресування раку. Відповідно до гіпотези диференціальної стресової сенсибілізації (DSS), поєднання голодування або ящуру з другим лікуванням є набагато перспективнішим11,12. Ця гіпотеза передбачає, що в той час як ракові клітини здатні пристосовуватися до обмежених концентрацій кисню та поживних речовин, багато типів ракових клітин не здатні виконувати зміни, які дозволили б вижити в токсичному середовищі з дефіцитом поживних речовин, створеним поєднанням голодування та хіміотерапії. , наприклад. Ранні експерименти з клітинами раку молочної залози, меланоми та гліоми виявили парадоксальне збільшення експресії генів, пов’язаних з проліферацією, або генів біогенезу та збірки рибосом у відповідь на голодування11,12. Такі зміни супроводжувалися несподіваною активацією AKT і S6K, схильністю до генерації ROS і пошкодження ДНК і сенсибілізацією до препаратів, що пошкоджують ДНК (через DSS)11.

Ми вважаємо таку невідповідну реакцію ракових клітин на змінені умови, включаючи зниження рівнів IGF1 і глюкози, викликане голодуванням або ящуром, ключовим механізмом, що лежить в основі протипухлинних властивостей цих дієтичних втручань і їх потенційної корисності для розділення ефектів протипухлинного лікування на нормальні та злоякісні клітини11,12 (рис. 1). Згідно з гіпотезою DSS, періодичних циклів голодування або ящуру достатньо, щоб уповільнити ріст багатьох типів пухлинних клітин, починаючи від клітинних ліній солідної пухлини та закінчуючи клітинами лімфоїдної лейкемії, у миші, і, що найважливіше, для сенсибілізації ракових клітин до хіміотерапевтичних засобів, променевої терапії та інгібіторів тирозинкінази (ІТК)11,17,22,25,50,54�57,59,60,124,127,128.

Знижуючи доступність глюкози та підвищуючи α-окислення жирних кислот, голодування або ящур також можуть сприяти переходу від аеробного гліколізу (ефект Варбурга) до мітохондріального окисного фосфорилювання в ракових клітинах, що необхідно для підтримки росту ракових клітин у середовищі з найбільшою кількістю поживних речовин50. (рис. 2). Це перемикання призводить до збільшення виробництва АФК11 в результаті підвищеної дихальної активності мітохондрій, а також може включати зниження клітинного окислювально-відновного потенціалу через зниження синтезу глутатіону в результаті гліколізу і пентозофосфатного шляху50. Комбінований ефект збільшення АФК та ​​зниженого антиоксидантного захисту підвищує окислювальний стрес у ракових клітинах та посилює активність хіміопрепаратів. Примітно, що оскільки висока гліколітична активність, продемонстрована високою продукцією лактату, є передвісником агресивності та схильності до метастазування у кількох типів раку129, антиварбургський ефект голодування або ящуру може бути особливо ефективним проти агресивного та метастатичного раку.

Крім зміни метаболізму, голодування або ящур викликають інші зміни, які можуть сприяти DSS у клітинах раку підшлункової залози. Голодування підвищує рівні експресії рівноважного транспортера нуклеозидів 1 (ENT1), транспортера гемцитабіну через плазматичну мембрану, що призводить до покращення активності цього препарату128. У клітинах раку молочної залози голодування викликає SUMO2-опосередковану та/або SUMO3-опосередковану модифікацію REV1, ДНК-полімерази та p53-зв’язуючого білка127. Ця модифікація зменшує здатність REV1 інгібувати р53, що призводить до посилення опосередкованої р53 транскрипції проапоптичних генів і, зрештою, до загибелі ракових клітин (рис. 2). Голодування також підвищує здатність ІТК, що зазвичай вводяться, зупиняти ріст та/або смерть ракових клітин шляхом посилення інгібування передачі сигналу MAPK і, таким чином, блокування експресії гена, залежного від транскрипційного фактора E2F, а також шляхом зменшення поглинання глюкози17,54.

Нарешті, голодування може посилити регуляцію рецептора лептину та його передачу сигналів через білок PR/SET домен 1 (PRDM1) і таким чином пригнічувати ініціацію та зворотне прогресування B-клітинної та T-клітинної гострої лімфобластної лейкемії (ALL), але не гострого мієлоїдного лейкозу. лейкемія (AML)55. Цікаво, що незалежне дослідження продемонструвало, що попередники В-клітин демонструють стан хронічного обмеження глюкози та запасів енергії, викликаного факторами транскрипції PAX5 та IKZF1 (посилання 130). Показано, що мутації в генах, що кодують ці два білки, які присутні більш ніж у 80% випадків пре-В-клітинної ГЛЛ, збільшують поглинання глюкози та рівні АТФ. Однак відновлення PAX5 та IKZF1 у клітинах preB-ALL призвело до енергетичної кризи та загибелі клітин. У поєднанні з попереднім дослідженням ця робота вказує на те, що ALL може бути чутливим до обмеження поживних речовин і енергії, яке накладається голодуванням, що, можливо, є хорошим клінічним кандидатом для перевірки ефективності голодування або ящуру.

Примітно, що цілком імовірно, що багато типів ракових клітин, включаючи AML29, можуть набути резистентності, обходячи метаболічні зміни, спричинені голодуванням або ящуром, можливість, яка ще більше збільшується через метаболічну гетерогенність, яка характеризує багато видів раку129. Таким чином, головною метою на найближче майбутнє буде виявлення типів раку, які найбільш сприйнятливі до цих дієтичних режимів за допомогою біомаркерів. З іншого боку, у поєднанні зі стандартною терапією голодування або ящур рідко призводили до набуття стійкості на моделях ракових мишей, а стійкість до голодування в поєднанні з хіміотерапією також є рідкісною в дослідженнях in vitro, що підкреслює важливість визначення методів лікування, які: у поєднанні з ящуром, призводять до сильного токсичного впливу на ракові клітини з мінімальною токсичністю для нормальних клітин і тканин11,17,50,55.

Підвищення протипухлинного імунітету голодуванням або ящуром

Останні дані свідчать про те, що голодування або ящур самі по собі, і більшою мірою в поєднанні з хіміотерапією, викликають розширення лімфоїдних клітин-попередників і сприяють імунній атаці пухлини через різні механізми25,56,60,124. Ящур знижував експресію HO1, білка, який забезпечує захист від окисного пошкодження та апоптозу, в ракових клітинах in vivo, але посилював експресію HO1 у нормальних клітинах124,131. Пригнічення HO1 у ракових клітинах опосередковує хіміосенсибілізацію, спричинену ящуром, шляхом посилення лімфоцитозалежної цитотоксичності, що інфільтрує пухлину CD8+, чому може сприяти пригнічення регуляторних Т-клітин124 (рис. 2). Інше дослідження, яке підтвердило здатність голодування або ящуру та міметиків CR покращувати протипухлинний імунний нагляд, передбачає, що протипухлинні ефекти голодування або ящуру можуть застосовуватися до аутофагічно компетентних, але не аутофагічно-дефіцитних раків56. Нарешті, нещодавнє дослідження голодування через день протягом 2 тижнів на мишачій моделі раку товстої кишки показало, що, активуючи аутофагію в ракових клітинах, голодування знижує експресію CD73 і, як наслідок, зменшує вироблення імуносупресивного аденозину раковими клітинами60. Зрештою, було показано, що зниження регуляції CD73 через голодування запобігає переходу макрофагів до імуносупресивного фенотипу M2 (рис. 2). На основі цих досліджень привабливо припустити, що ящури можуть бути особливо корисними замість або в поєднанні з інгібіторами імунних контрольних точок132, протираковими вакцинами або іншими препаратами, які стимулюють протипухлинний імунітет, включаючи деякі звичайні хіміотерапевтичні засоби133.

Протиракові дієти в моделях мишей

Загалом, результати доклінічних досліджень голодування або ящуру на моделях раку у тварин, включаючи моделі для метастатичного раку (Таблиця 2), показують, що періодичне голодування або ящур досягають плейотропного протипухлинного ефекту та потенціюють активність хіміопрепаратів та ІТК, надаючи захисний та регенеративний ефект. в багатьох органах22,25. Досягнення тих самих ефектів без голодування та/або ящуру вимагало б спочатку ідентифікації, а потім використання кількох ефективних, дорогих і часто токсичних препаратів, і, ймовірно, було б без переваги стимулювання здорового захисту клітин. Примітно, що принаймні у двох дослідженнях голодування в поєднанні з хіміотерапією виявилося єдиним заходом, здатним досягти або повної регресії пухлини, або довготривалого виживання у стабільної частини тварин, які отримували лікування11,59.

Хронічні KD також виявляють ефект затримки росту пухлини при застосуванні як монотерапії, особливо на мишачих моделях раку мозку77,78,80�82,84,134. Гліоми у мишей, які підтримувалися на хронічному KD, мають знижену експресію маркера гіпоксії карбоангідрази 9 і фактора 1?, індукованого гіпоксією, знижену активацію ядерного фактора-?B і знижену експресію судинного маркера (тобто рецептора 2 фактора росту судинного ендотелію, матрична металопротеїназа 2 і віментин)86. У внутрішньочерепній мишачій моделі гліоми миші, яких годували KD, демонстрували посилені вроджені та адаптивні імунні відповіді, що реагують на пухлину, які в основному опосередковувалися CD8+ Т-клітинами79. Показано, що КД покращують активність карбоплатину, циклофосфаміду та променевої терапії на мишачих моделях гліоми, раку легенів і нейробластоми73–75,135. Крім того, нещодавнє дослідження показує, що KD може бути дуже корисним у поєднанні з інгібіторами PI3K72. Блокуючи передачу сигналів інсуліну, ці агенти сприяють розщепленню глікогену в печінці та запобігають поглинанню глюкози скелетними м’язами, що призводить до транзиторної гіперглікемії та компенсаторного вивільнення інсуліну з підшлункової залози (явище, відоме як «інсуліновий зворотний зв’язок»). У свою чергу, таке підвищення рівня інсуліну, яке може бути тривалим, особливо у пацієнтів з резистентністю до інсуліну, реактивує передачу сигналів PI3K�mTOR в пухлинах, таким чином сильно обмежуючи користь інгібіторів PI3K. Було показано, що KD є дуже ефективним у запобіганні зворотного зв’язку інсуліну у відповідь на ці препарати та значно покращує їх протипухлинну активність у мишей. Нарешті, згідно з дослідженням моделі кахексії, спричиненої пухлиною мишей (пухлини MAC16), КД можуть допомогти запобігти втраті жирової та нежирової маси тіла у хворих на рак85.

CR знижує пухлиноутворення в моделях генетичного раку мишей, моделях мишей зі спонтанним пухлиноутворенням і мишачих моделях індукованого канцерогеном раку, а також у мавп91,92,97,98,101,102,104�106,108,109,136�138. Навпаки, дослідження показало, що CR із середнього віку фактично збільшує частоту новоутворень плазматичних клітин у мишей C57Bl/6. Однак у цьому ж дослідженні CR також подовжив максимальну тривалість життя приблизно на 139%, а спостережуване збільшення захворюваності на рак пояснюється збільшенням довголіття мишей, яким проводили CR, віком смерті мишей із пухлиною, які проходили CR, і відсотком раку. миші з пухлиною, які проходили CR, які померли. Таким чином, автори дійшли висновку, що CR, ймовірно, уповільнює просування та/або прогресування існуючих лімфоїдних раків. Мета-аналіз, у якому порівнювали хронічний CR з переривчастим CR з точки зору їх здатності запобігати раку у гризунів, зробив висновок, що переривчастий CR є більш ефективним у генетично модифікованих моделях мишей, але він менш ефективний у хімічно індукованих моделях щурів15. Було показано, що CR уповільнює ріст пухлини та/або подовжує виживаність мишей у різних мишачих моделях раку, включаючи рак яєчників і підшлункової залози90 та нейробластому140,94.

Важливо, що CR покращив активність протипухлинного лікування в кількох моделях раку, включаючи активність антитіл проти IGF1R (ганітумаб) проти раку передміхурової залози141, циклофосфаміду проти клітин нейробластоми135 та інгібування аутофагії в ксенотрансплантатах безсмертних епітеліальних клітин нирок миші, трансформованих HRAS-G12V100. Однак CR або KD у поєднанні з протипухлинною терапією здається менш ефективним, ніж голодування. Дослідження на мишах показало, що, на відміну від голодування, сам по собі CR не зміг зменшити ріст підшкірно зростаючих гліом GL26 мишей і що, знову ж таки, на відміну від короткочасного голодування, CR не підвищував активність цисплатину проти підшкірної 4T1 молочної залози. пухлини51. У цьому ж дослідженні голодування також виявилося значно ефективнішим, ніж CR і KD, для підвищення переносимості доксорубіцину51. Хоча голодування або ящур, CR і KD, ймовірно, впливають на сигнальні шляхи, що перекриваються, і модулюють їх, голодування або ящур, ймовірно, впливають на такі механізми більш різко під час інтенсивної гострої фази максимальною тривалістю кілька днів.

Фаза відновлення харчування може сприяти відновленню гомеостазу всього організму, а також активувати та активізувати механізми, які можуть сприяти розпізнаванню та видаленню пухлини та регенерації здорових клітин. CR та KD є хронічними втручаннями, які здатні лише помірно пригнічувати шлях сприйняття поживних речовин, можливо, не досягаючи певних порогових значень, необхідних для покращення ефектів протипухлинних препаратів, водночас створюючи великий тягар і часто прогресивну втрату ваги. CR та KD як хронічні дієтичні режими у хворих на рак важко реалізувати та, ймовірно, несуть ризики для здоров’я. CR, ймовірно, призведе до серйозної втрати сухої маси тіла та зниження рівня стероїдних гормонів і, можливо, імунної функції142. Хронічні хвороби серця також пов’язані з подібними, хоча й менш серйозними побічними ефектами143. Таким чином, періодичні цикли голодування та ящуру тривалістю менше 5 днів, що застосовуються разом із стандартною терапією, мають високий потенціал для покращення лікування раку, одночасно зменшуючи його побічні ефекти. Примітно, що буде важливо вивчити ефект комбінації періодичних ящурів, хронічних захворювань ураження та стандартної терапії, особливо для лікування агресивних видів раку, таких як гліома.

Голодування та ящур у профілактиці раку

Епідеміологічні дослідження та дослідження на тваринах, включаючи мавп108,109,144, і людей підтверджують думку про те, що хронічний CR та періодичне голодування та/або ящур можуть мати профілактичні ефекти у людей. Тим не менш, CR навряд чи може бути реалізований серед населення в цілому через проблеми дотримання та можливі побічні ефекти115. Таким чином, у той час як рекомендації щодо продуктів, які слід віддавати перевагу (або уникати), а також рекомендації щодо способу життя для зниження ризику раку стають створеними6,8,9,15, тепер мета полягає в тому, щоб визначити та, можливо, стандартизувати добре переносимі, періодичні дієти з низьким або відсутністю побічних ефектів та оцінити їх ефективність у профілактиці раку в клінічних дослідженнях.

Як обговорювалося раніше, цикли ящуру спричиняють зниження регуляції IGF1 і глюкози та підвищення регуляції IGFBP1 і кетонових тіл, що є змінами, подібними до тих, що викликані самим голодуванням, і є біомаркерами реакції натщесерце22. Коли мишей C57Bl/6 (у яких з віком спонтанно розвиваються пухлини, головним чином лімфоми) годували таким ящуром протягом 4 днів двічі на місяць, починаючи з середнього віку, і довільною дієтою в період між циклами ящуру, частота новоутворень становила знизився з приблизно 70% у мишей на контрольній дієті до приблизно 40% у мишей у групі ящуру (загальне зниження на 43%)22. Крім того, ящур більш ніж на 3 місяці відстрочив виникнення смертельних випадків, пов’язаних з новоутвореннями, а кількість тварин із множинними аномальними ураженнями була більш ніж у три рази вищою в контрольній групі, ніж у мишах із ящуром, що свідчить про те, що багато пухлин у мишей із ящуром були менш агресивні або доброякісні.

Попереднє дослідження щоденного голодування, яке проводилося на мишах середнього віку протягом 4 місяців, також виявило, що голодування зменшило частоту лімфом, збільшивши її з 33% (у контрольних мишей) до 0% (у голодних мишей). тварин)145, хоча через коротку тривалість дослідження невідомо, чи цей режим голодування запобіг або просто відстрочив появу пухлини. Крім того, голодування через день вимагає 15 днів на місяць повного голодування лише на воді, тоді як у описаному вище експерименті з ящуром мишей посадили на дієту, яка забезпечувала обмежену кількість їжі лише протягом 8 днів на місяць. Було показано, що у людей 3 цикли 5-денного ящуру один раз на місяць зменшують абдомінальне ожиріння та маркери запалення, а також рівні IGF1 і глюкози у суб’єктів із підвищеним рівнем цих маркерів62, що вказує на те, що періодичне використання ящуру потенційно може мати профілактичні ефекти щодо пов’язаних із ожирінням або запаленням, а також інших ракових захворювань у людей, як це було показано на мишах22.

Таким чином, багатообіцяючі результати доклінічних досліджень у поєднанні з клінічними даними про вплив ящуру на фактори ризику захворювань, пов’язаних зі старінням, включаючи рак62, підтверджують майбутні рандомізовані дослідження ящуру як можливо ефективного інструменту запобігання раку, а також як і інші хронічні захворювання, пов’язані зі старінням, у людей.

Клінічна застосовність в онкології

Станом на сьогодні опубліковано чотири техніко-економічні дослідження щодо голодування та ящуру у пацієнтів, які проходять хіміотерапію52,53,58,61. У серії випадків із 10 пацієнтів із діагностованими різними типами раку, включаючи рак молочної залози, простати, яєчників, матки, легенів та стравоходу, які добровільно голодували до 140 годин до та/або до 56 годин після хіміотерапії, серйозних побічних ефектів не спричинило. повідомлялося про голодування, крім голоду та запаморочення58. Ті пацієнти (шість), які проходили хіміотерапію натщесерце та без нього, повідомили про значне зниження втоми, слабкості та шлунково-кишкових побічних ефектів під час голодування. Крім того, у тих пацієнтів, у яких можна було оцінити прогресування раку, голодування не запобігало спричиненому хіміотерапією зменшенням об’єму пухлини або онкомаркерам. В іншому дослідженні 13 жінок із HER2 (також відомим як ERBB2) негативним, рак молочної залози II/III стадії, які отримували неоад’ювантну хіміотерапію таксотером, адріаміцином та циклофосфамідом (TAC), були рандомізовані на швидку (лише воду) за 24 години до та після початку хіміотерапії або до харчування відповідно до стандартних рекомендацій52.

Короткочасне голодування добре переносилося та зменшило падіння середньої кількості еритроцитів і тромбоцитів через 7 днів після хіміотерапії. Цікаво, що в цьому дослідженні рівні ?-H2AX (маркера пошкодження ДНК) були підвищені через 30 хвилин після хіміотерапії в лейкоцитах пацієнтів, які не голодували, але не у пацієнтів, які голодували. Під час збільшення дози голодування у пацієнтів, які проходили хіміотерапію на основі платини, 20 пацієнтів (які в основному отримували лікування уротеліального раку, раку яєчників або молочної залози) були рандомізовані для голодування протягом 24, 48 або 72 годин (розділених на 48 годин до хіміотерапії та 24 години після хіміотерапії )53. Критерії здійсненності (визначені як три або більше з шести суб’єктів у кожній когорті, які споживають?200 ккал на день протягом швидкого періоду без надмірної токсичності) були виконані. Токсичність, пов’язана з голодуванням, завжди була 2 ступеня або нижче, найпоширенішими були втома, головний біль і запаморочення. Як і в попередньому дослідженні, у цьому невеликому дослідженні також можна було виявити зменшення пошкодження ДНК (як виявлено кометним аналізом) у лейкоцитах суб’єктів, які голодували принаймні 48 годин (у порівнянні з суб’єктами, які голодували лише 24 години). Крім того, також була задокументована незначна тенденція до зменшення нейтропенії 3 або 4 ступеня у пацієнтів, які голодували протягом 48 і 72 годин, порівняно з тими, хто голодував лише 24 години.

Зовсім нещодавно було проведено рандомізоване перехресне клінічне дослідження для оцінки впливу ящуру на якість життя та побічних ефектів хіміотерапії загалом у 34 пацієнтів з раком молочної залози або яєчників61. Ящур складався з добового споживання калорій <400 ккал, переважно соків і бульйонів, починаючи з 36-48 годин до початку хіміотерапії і триваючи до 24 годин після закінчення хіміотерапії. У цьому дослідженні ящур запобігав зниженню якості життя, спричиненому хіміотерапією, а також зменшував втому. Знову ж таки, жодних серйозних побічних ящуру не повідомлялося. Кілька інших клінічних випробувань ящурів у поєднанні з хіміотерапією або іншими типами активного лікування зараз тривають у лікарнях США та Європи, головним чином у пацієнтів, у яких діагностовано рак молочної залози або передміхурової залози63,65–68. Це або одногрупові клінічні дослідження для оцінки безпеки та можливості застосування ящуру, або рандомізовані клінічні дослідження, зосереджені або на впливі ящуру на токсичність хіміотерапії, або на якість життя пацієнтів під час самої хіміотерапії. Загалом у цих дослідженнях взяли участь понад 300 пацієнтів, і очікується, що їхні перші результати стануть доступними у 2019 році.

Проблеми в клініці

Вивчення періодичного голодування або ящуру в онкології не позбавлене занепокоєння, особливо щодо можливості того, що цей тип дієтичного режиму може спровокувати недоїдання, саркопенію та кахексію у схильних або слабких пацієнтів (наприклад, пацієнтів, у яких розвивається анорексія як наслідок хіміотерапії)18,19. Однак у клінічних дослідженнях голодування в поєднанні з хіміотерапією, опублікованих на даний момент, не було повідомлено про випадки серйозної (вище 3 ступеня) втрати ваги або недоїдання, і ті пацієнти, у яких була втрата ваги під час голодування, зазвичай відновлювали свою вагу до наступного циклу без видимої шкоди. Незважаючи на це, ми рекомендуємо, щоб періодична анорексія та оцінка харчового статусу з використанням підходів золотого стандарту18,19,146–150 були невід’ємною частиною цих досліджень і щоб будь-яке подальше порушення харчування у пацієнтів, які проходять голодування та/або ящур, було швидко скориговано.

Висновки

Періодичне голодування або ящур постійно демонструють потужний протипухлинний ефект на моделях раку мишей, включаючи здатність потенціювати хіміопроменеву терапію та ІТК та викликати протираковий імунітет. Цикли ящуру є більш здійсненними, ніж режими хронічної дієти, оскільки вони дозволяють пацієнтам регулярно споживати їжу під час ящуру, підтримувати нормальну дієту між циклами і не призводять до сильної втрати ваги та, можливо, згубного впливу на імунну та ендокринну системи. Примітно, що як самостійна терапія, періодичне голодування або цикли ящуру, ймовірно, демонструють обмежену ефективність проти встановлених пухлин. Насправді, у мишей голодування або ящур впливають на прогресування ряду ракових захворювань так само, як і хіміотерапія, але окремо вони рідко відповідають ефекту, отриманому в комбінації з ліками від раку, що може призвести до виживання без раку11,59. Таким чином, ми припускаємо, що саме комбінація періодичних циклів ящуру зі стандартними методами лікування має найвищий потенціал для сприяння виживанню пацієнтів без раку, як припускають мишачі моделі11,59 (рис. 3).

Ця комбінація може бути особливо сильною з кількох причин: по-перше, ліки від раку та інші методи лікування можуть бути ефективними, але частина пацієнтів не реагує, оскільки ракові клітини приймають альтернативні метаболічні стратегії, що ведуть до виживання. Ці альтернативні метаболічні режими набагато важче підтримувати в умовах голодування або ящуру через дефіцит або зміни глюкози, певних амінокислот, гормонів і факторів росту, а також інших невідомих шляхів, що призводять до загибелі клітин. По-друге, голодування або ящур можуть запобігти або зменшити розвиток резистентності. По-третє, голодування або ящур захищають нормальні клітини та органи від побічних ефектів, спричинених різноманітними ліками від раку. На підставі доклінічних і клінічних доказів здійсненності, безпеки та ефективності (для зниження IGF1, вісцерального жиру та серцево-судинних факторів ризику), ящур також виглядає як життєздатний дієтичний підхід, який слід вивчати для профілактики раку. Важливим завданням майбутнього буде виявлення тих пухлин, які є найкращими кандидатами на користь від голодування або ящуру. Навіть у тих типів раку, які, очевидно, менш сприйнятливі до голодування або ящуру, можливо виявити механізми резистентності та втрутитися за допомогою ліків, здатних повернути цю резистентність. І навпаки, слід бути обережнішими з іншими типами дієт, особливо якщо вони містять багато калорій, оскільки вони можуть призвести до загострення, а не пригнічення розвитку деяких видів раку. Наприклад, KD збільшує ріст моделі меланоми з мутованим BRAF у мишей123, а також повідомлялося про прискорення прогресування захворювання в мишачій моделі AML72.

Крім того, дуже важливо застосовувати ящури з розумінням механізмів дії, оскільки їх потужність у разі неправильного застосування може призвести до негативних наслідків. Наприклад, коли щурів голодували та лікували потужним канцерогеном перед повторним годуванням, це призводило до зростання аномальних вогнищ у печінці, товстій кишці та прямій кишці порівняно з щурами, які не голодували151,152. Хоча механізми, залучені до цього ефекту, не зрозумілі, і ці вогнища, можливо, не призвели до пухлин, ці дослідження показують, що мінімальний період 24–48 годин між хіміотерапією та поверненням до нормального харчування є важливим, щоб уникнути поєднання повторного росту сигнали, присутні під час повторного годування після голодування з високим рівнем токсичних препаратів, таких як хіміотерапія. Клінічні дослідження голодування або ящуру у пацієнтів, які проходять хіміотерапію, підтверджують його доцільність і загальну безпеку52,53,58,61. У невеликому рандомізованому дослідженні, яке охопило 34 пацієнти, ящур допоміг пацієнтам зберегти якість життя під час хіміотерапії та зменшити втому61. Крім того, попередні дані свідчать про потенціал голодування або ящуру для зменшення спричиненого хіміотерапією пошкодження ДНК у здорових клітинах пацієнтів52,53.

Поточні клінічні дослідження ящурів у хворих на рак63,65–68 дадуть більш обґрунтовані відповіді щодо того, чи допомагає призначення періодичних ящурів у поєднанні зі звичайними протипухлинними засобами покращити переносимість і активність останніх. Важливо враховувати, що ящури не будуть ефективними для зменшення побічних ефектів лікування раку в усіх пацієнтів, а також вони не покращуватимуть ефективність усіх методів лікування, але вони мають великий потенціал, щоб зробити це принаймні для частини та, можливо, для основної частини пацієнтів і ліків. Ослаблених пацієнтів або пацієнтів із недостатнім харчуванням або пацієнтів із ризиком недоїдання не слід брати участь у клінічних дослідженнях голодування чи ящуру, а під час клінічних випробувань слід ретельно контролювати стан харчування пацієнтів та анорексію. Необхідне споживання білків, незамінних жирних кислот, вітамінів і мінералів у поєднанні, де це можливо, з легкою та/або помірною фізичною активністю, спрямованою на збільшення м’язової маси, має застосовуватися між циклами голодування або ящуру, щоб пацієнти підтримували здорове м’яке тіло. маса18,19. Цей мультимодальний дієтичний підхід максимізує переваги голодування або ящуру, водночас захищаючи пацієнтів від недоїдання.

Список використаної літератури: